前言

近期，廣東、廣西等地相繼報告基孔肯雅熱本地感染病例，引發(fā)公共衛(wèi)生部門高度警惕。

如今正值我國基孔肯雅疫情防控的關(guān)鍵時期，在此背景下，8月28日，國家藥監(jiān)局器審中心發(fā)布《基孔肯雅病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點(diǎn)（試行）》（以下簡稱《審評要點(diǎn)》），我們將其中第二部分注冊審查要點(diǎn)的“分析性能研究”內(nèi)容轉(zhuǎn)載如下：

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析結(jié)果等詳細(xì)資料。

如申報產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。

如果試劑同時適用于血清和血漿樣本類型，可選擇具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的樣本進(jìn)行不同樣本類型一致性的同源比對研究。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。

分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本，如需稀釋，應(yīng)采用陰性樣本進(jìn)行稀釋。

建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.樣本穩(wěn)定性

2.核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

3.精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強(qiáng)陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/span>

陰性樣本：待測物濃度為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

4.分析特異性

4.1交叉反應(yīng)

4.1.1生物信息學(xué)分析

分析應(yīng)當(dāng)包括人基因組和其他近緣病毒、引起發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、出疹等相似癥狀的病原體。

4.1.2樣本驗(yàn)證

采用滅活的臨床樣本或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

4.1.2.1發(fā)熱伴出疹相關(guān)病原體

登革病毒（DENV-1～DENV-4）、辛德畢斯病毒、蓋塔病毒、黃熱病毒、寨卡病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙型腦炎病毒*、水痘-帶狀皰疹病毒*、單純皰疹病毒*、細(xì)小病毒B19*、人類皰疹病毒 6*、人類皰疹病毒 7*、肺炎衣原體*、志賀氏菌*、淋球菌*、溶血性鏈球菌*、立克次體*。

注：“*”項(xiàng)為選擇性驗(yàn)證的病原體，可在其中選擇不少于9個進(jìn)行驗(yàn)證。

4.1.2.2可能在血液樣本中存在的其他常見病原體

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒。

4.1.2.3高濃度人類基因組DNA

病毒培養(yǎng)液的濃度單位可采用TCID50或PFU/mL，細(xì)菌培養(yǎng)物濃度單位可采用CFU/mL。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高，也可采用其他合理的方法對病原體濃度進(jìn)行定值，提交相關(guān)依據(jù)。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別信息和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

4.2干擾

4.2.1干擾物質(zhì)研究 

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證推薦物質(zhì)見表1。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的基孔肯雅病毒樣本。對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的Ct值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

表1 用于干擾試驗(yàn)的物質(zhì)

抗病毒藥：如利巴韋林

解熱鎮(zhèn)痛藥：如對乙酰氨基酚

抗生素：如阿莫西林

激素類藥物：如地塞米松

抗凝劑：如肝素

內(nèi)源性干擾物質(zhì)：血紅蛋白、甘油三酯、白蛋白、膽紅素等

4.2.2病原體干擾研究

應(yīng)充分考慮臨床上容易與基孔肯雅病毒合并感染的病原體（如登革病毒等）及“4.1.1”中經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示存在較高同源性的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）基孔肯雅病毒核酸檢測的影響，進(jìn)行干擾研究。

5.檢出限

5.1檢出限的確定

建議采用至少3個樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個濃度梯度重復(fù)檢測，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

5.2檢出限的驗(yàn)證

選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。

如檢測試劑包括多個可單獨(dú)報告的檢測靶標(biāo)，應(yīng)分別進(jìn)行檢出限研究。

6.包容性

6.1 應(yīng)當(dāng)采用生物信息學(xué)分析方法對產(chǎn)品檢測的包容性進(jìn)行研究，對所有已公布的基孔肯雅病毒核酸序列進(jìn)行序列比對分析，并對靶標(biāo)范圍內(nèi)的序列差異是否影響申報產(chǎn)品檢出能力進(jìn)行分析驗(yàn)證。

6.2 驗(yàn)證至少10個不同來源的臨床陽性樣本。研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗(yàn)證。

6.3 基因型覆蓋

應(yīng)對基孔肯雅病毒主要基因型，包括西非型、東中南非型（包含印度洋分支）、亞洲型及其他流行變異株進(jìn)行包容性研究。研究可采用毒株或臨床樣本，如果樣本難以獲得，亦可采用假病毒。

7.企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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